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MEIOS DE CULTURA

 Objetivo: Familiarizar o aluno com o preparo dos meios de cultura mais usados em microbiologia; Discutir a aplicação de meios específicos para o cultivo de microrganismos distintos

 Princípio: Os microrganismos, para um crescimento adequado, necessitam de nutrientes (fontes de carbono, nitrogênio, enxofre, fosfato, etc., ) e condições ambientais favoráveis (pH, pressão osmótica, temperatura, umidade, etc., ).

            Meios de cultura são associação qualitativa e quantitativa de substâncias que permitem o cultivo de microrganismos fora do meio natural. Em condições naturais, nos diversos “habitats”, os microrganismos ocorrem em populações mistas. Os meios de cultura permitem isolar os microrganismos para estudo e pesquisa.

 Material: Peptona, extrato de carne, ágar-agar,  ágar Mueller-Hinton, Caldo BHI, sangue de carneiro desfibrinado, tubos contendo 10ml de ágar-base estéril PH-metron, placas de Petri estéreis, pipetas de 1ml estéril, balança, provetas.

Equipamentos: Autoclave, cronômetro, Banho-Maria a 55ºC

Método - Formulações

Caldo Simples

Peptona.....................5,0g

Extrato de carne  ......3,0g

Água destilada .... 1000ml

      Pesar os ingredientes, dissolver em água destildada e acertar o pH para  7,3. Distribuir em 2ml/tubo. Autoclavar 120°C por 15'. Manter em geladeira.

 

 

Ágar Simples

Ágar.................... 15,0g

Peptona................. 5,0g

Extrato de carne ....3,0g

Água destilada ...1000ml

      Pesar os ingredientes e dissolver a quente. Acertar o pH para 7,3. Autoclavar 120°C por 15'. Distribuir em placas. Manter em geladeira.

 

 

Ágar Sangue: Adicionar sangue de carneiro desfribinado no ágar nutriente fundido e resfriado a 55ºC, na proporção de 5%, ou seja, para cada 10ml do ágar nutriente adicionar 0,5ml do sangue. Homogeneizar e distribuir em placas.

 

Ágar Chocolate: Adicionar sangue de carneiro desfribinado no ágar nutriente fundido e resfriado a 70ºC, na proporção de 5%, ou seja, para cada 10ml do ágar nutriente adicionar 0,5ml do sangue. Homogeneizar e distribuir em placas.

 

Ágar Mueller Hinton

 

Composição (g/litro)

 

Infuso de carne .......300g

Casaminoácido .......17,5g

Amido......................1,5g

Ágar .........................17g

 

pH final 7,3

MODO DE PREPARAÇÃO

Suspender 38,0g em 1000ml de água destilada ou deionizada e aquecer até ebulição para dissolver completamente. Esterilizar em autoclave durante 10 min.,  a 15 Atm pressão (121ºC), esfriar a 50ºC e distribuir em placas de Petri.

 

Caldo BHI (Brain Heart Infusion)

Composição (g/litro)

Infuso de cérebro de carneiro...200g

Infuso de coração bovino ......  250g

Peptona proteosa, Difco .........  10g

Dextrose ................................... 2g

Cloreto de sódio ......................   5g

Fosfato disódico ....................  2,5g

 

Modo de preparação

         

           Dissolver 37 gramas em um litro de água destilada ou deionizada. Agitar até completa dissolução. Esterilizar em autoclave durante 15 minutos a 15 atm.

pH final 7,4

 

Meio P/ Teste de Motilidade

 

 Triptose ................. 10,0g

Cloreto de sódio ......  5,0g

Ágar-ágar ................  5,0g

Modo de preparação

Suspender 20g do pó em 1000ml de água destilada ou deionizada e aquecer até ebulição para dissolver completamente.  Distribuir em tubos e esterilizar em autoclave durante 15 min.,  a 15 Atm pressão (121ºC), esfriar o meio com o tubo em posição vertical

 

 

COMENTÁRIOS

 

            Desde o inicio, os microbiologistas aprenderam que podiam cultivar uma grande variedade de bactérias em “caldos”, obtidos pela cocção de tecidos animais ou vegetais. Em 1923, Mueller[1], tentando definir esta vaga necessidade, em termos de compostos específicos, descobriu o então desconhecido aminoácido, metionina. A nutrição bacteriana tornou-se campo dinâmico durante os anos subsequentes; porém com o reconhecimento da unidade bioquímica, os vários esquemas nutritivos revelaram ser simplesmente pequenas variações de um tema central e o estudo da nutrição bacteriana perdeu muito de seu interesse teórico. Apesar disso, este campo detém sua importância prática e ainda apresenta desafios; por exemplos, o bacilo da lepra, o treponema da sífilis e riquétsias não podem ser cultivados em meios artificiais.

            Inicialmente, o único método existente para contagem de bactérias ou para o isolamento de culturas puras (clones), era a diluição até a extinção, isto é, até a perda da infectividade. Um progresso importante foi a introdução dos meios sólidos por Koch. Os materiais usados inicialmente eram pouco satisfatórios: a superfície da batata cortada podia permitir um crescimento confluente, enquanto que a gelatina permanecia sólida apenas em temperaturas relativamente baixas, sendo liquefeita por muitos microrganismos. Assim sendo, Frau Hesse, esposa de um médico e bacteriologista amador alemão, introduziu o ágar, um produto japonês que ela empregava  para engrossar as sopas.

            O ágar (do malaio “agar-ágar”) é um polissacarídeo obtido de certas algas marinhas (várias algas vermelhas). Constitui-se primariamente de galactose, com um radical sulfato para cada 10 ou 50 resíduos. O ágar mostrou-se ideal para formar meios sólidos. Não é tóxico para a bactéria, e muito poucas conseguem atacá-lo. Em concentrações de 1,5 a 2,0% apresentam uma superfície úmida para permitir crescimento, mas seca o bastante para manter separadas as colônias (Excepcionalmente, certos microrganismos móveis, como Proteus, exigem ágar a 5% para impedir a formação do véu.

            Após a fusão entre 80 e 100ºC, as soluções de ágar permanecem líquidas até 45-50ºC, temperatura que muitas bactérias toleram por alguns instantes; após a solidificação em temperatura ambiente, permanecem sólidas até muito acima de 37ºC. A estrutura fibrosa de um gel é suficientemente compacta para impedir a movimentação de bactérias no seu interior, mas bastante aberta para permitir a difusão, até mesmo de nutrientes macromoleculares.

 

QUESTÕES

 

  1. As condições necessárias para preparar os meios de cultura foram observadas? Qual a influencia dessas condições para a conclusão dos trabalhos?
  2. Os procedimentos realizados estão de acordo com o protocolo. Comente as alterações ou adaptações realizadas
  3. Relacione os matérias listados neste protocolo que não foram utilizados e quais outros materiais utilizados. Será que houve alguma falha no procedimento pela falta ou substituição do material?
  4. O que são macronutrientes ? Cite os principais exemplos
  5. Os meios de cultivo e a idade da colônia exercem alguma influência na morfologia de células em coloração simples?
  6. Alguns microrganismos, como Micobacterium leprae, ainda não se conseguiu cultivar em meios de cultura. Quais as possíveis dificuldades e qual a importância desta técnica?
  7. Quais as dificuldades encontradas na realização dessa prática?
  8. Descreva os procedimentos para realização do teste de esterilidade dos meios de cultura
  9. Os procedimentos de biossegurança foram seguidos com rigor? Quais os possíveis riscos de acidente de trabalho que os alunos e o professor sofreram? Comente sobre as normas de biossegurança.
  10. Elabore 10 questões a respeito da prática ao seu professor, para melhor esclarecimento das suas dúvidas

 



[1] J.Bacteriol., 7:309 (1922)

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