ESTREPTOCOCOS

Objetivos: Demonstrar as características morfológicas e propriedades bioquímicas dos estreptococos

Princípio: São cocos Gram-positivos que nos  esfregaços corados pelo método de Gram apresentam-se tipicamente em cadeias. São anaeróbios facultativos ou estritos, catalase negativa, homofermentadores da glicose (ácido láctico)

Material: Bateria  de coloração de Gram,  tubinho (120mm), pipetas de 2 ml, água oxigenada a 3%, Placas de ágar sangue  e meio de bile-esculina  dividida em três áreas, onde em cada uma área tem cultivado Streptococos alfa, beta e gama hemolíticos,  placas com ágar sangue, discos de bacitracina,  optoquina, caldo tripticase-soja (TSB), vermelho-fenol (0,02%) , solução de hidróxido de sódio 1N., solução de desoxicolato de sódio a 2%, salina estéril, desoxicolato de sódio a 2%, caldo cloretado, Meio com Teste Camp

Método: Observar as placas com cultura bacteriana, anotar as características coloniais, tipo de hemólise  e realizar os seguintes testes:

• Coloração de Gram
• Catalase
• Reação hemolítica em àgar sangue,
• Sensibilidade à bacitracina,
• Sensibilidade à optoquina,
• Prova bile-esculina,
• Tolerância ao cloreto de sódio a 6,%,
• Bile-solubilidade
• Prova do CAMP

Coloração de Gram

• Fazer esfregaços em lâminas e fixar pelo calor
• Cobrir a área do esfregaço com a solução  de cristal-violeta  por cerca de 1min.;
• Lavar com água corrente e escorrer o excesso de água;
• Cobrir a área do esfregaço com a solução de iodo durante cerca de 1 minuto;
• Descorar a lâmina com a mistura álcool-acetona, até que o solvente escorra incolor;
• Cobrir o esfregaço com a solução de safranina¹ por cerca de 30 segundos;
• Lavar com água corrente;
• Deixar secar ao ar .

Os estreptococos são visualizados como cocos Gram-positivos (roxo) isolados e agrupados em forma de cadeias

Prova da Catalase

                A catalase presente na maior parte das bactérias atua na reação:

      2H₂O₂      catalase           2H₂O + O₂

                Colocar em um tubinho (120mm) 1 ou 2 ml de água destilada, emulsionar quantidade suficiente de colônias de Streptococcus sp. para obter uma suspensão espessa; acrescentar-lhe 3 gotas de água oxigenada a 3%. Não agitar. O não desprendimento de bolhas de gás indica a ausência de catalase.

Reação hemolítica em ágar sangue

                Teste: Semear a bactéria em ágar sangue, incubar a 37ºc por 24 a 48 horas. Observar o tipo de hemólise.

De acordo com a característica apresentada em àgar sangue de carneiro os estreptococos podem ser caracterizados como sendo do tipo alfa, beta ou gama.

                O tipo de hemólise produzido é muito útil para a identificação inicial dos estreptococos; entretanto, deve se ter o cuidado com a origem do sangue visto que havendo esta variação pode haver mudança no comportamento do estreptococo quanto à produção da hemólise. Um cuidado adicional que também deve-se ter é quanto à escolha do àgar base para a preparação do àgar sangue. Recomenda-se, para que sejam evidenciadas as propriedades líticas dos estreptococos em meio isento de açúcares redutores.

                Os estreptococos alfa hemolíticos caracterizam-se por apresentar uma hemólise incompleta, além de possuir uma coloração esverdeada, daí serem denominados de “viridans”.

                Os estreptococos beta hemolíticos produzem hemólise clara e completa, frequentemente amarelado e os estreptococos do tipo gama, de menor importância clínica, nâo produzem hemólise.

Sensibilidade à Bacitracina,

O inóculo poderá ser obtido a partir do crescimento em meio de Todd Hewitt (T.H,) ou, quando possível, diretamente de colônias de ágar-sangue. O caldo T.H. pode ser substituído por outro que propicie crescimento abundante.

Semear em ágar-sangue uma área retangular (2cm de largura e 4cm de comprimento, aproximadamente). Depositar o disco de bacitracina no centro desta área. Incubar  35 a 37°C por 18 a 24 horas. Cada placa de ágar-sangue comporta 4 testes.

Normas recomendadas para a realização e interpretação do teste da bacitracina (Sonnenwirth, 1983):

• ØUsar apenas discos de diferenciação com 0,04m. Os discos para antibiograma que contém lm não se prestam para os testes.
• ØTrabalhar com inóculos espessos e de cultura pura, para evitar que espécies de outros grupos demonstrem falsa sensibilidade em decorrência da escassez de microrganismos.
• ØTestar amostras comprovadamente beta-hemolíticas, pois alguns Streptococcus alfa também são sensíveis à bacitracina 0,04m.
• ØConsiderar qualquer halo de leitura como sensível.

Sensibilidade à Optoquina.

A semeadura é feita como a descrita para a bactracina.

Incubar a 35°C 18 horas em microaerofilia.

Os halos de sensibilidade serão considerados em função do diâmetro dos discos.

Discos medindo 6mm   - halos 14mm ou mais: sensível

                                    - halos entre 6 a 14mm: questionável

Discos medindo10mm  - halos 16 ou mais: sensível

                                    - halos entre l0 a 16mm: questionável

Os testes questionáveis serão confirmados pela bile-solubilidade.

Prova Bile-Esculina

lnocular duas a três colônias ou uma alçada de crescimento do meio de bile-esculina (item 8.5.21). Este meio é distribuído em tubos com camada inclinada. lnocular o bísel. lncubar a 35ºC, por 48 horas.

Considera-se a prova como positiva quando mais da metade do bísel ficar enegrecido em 48 horas.

Bile-Solubilidade

Este teste poderá ser realizado empregando-se meio de cultura liquido com crescimento de Streptococcus pneumoniae ou diretamente na placa de Petri com crescimento deste microrganismo. Neste caso, poderá ser aproveitada a placa utilizada no teste da optoquina, procurando analisar o crescimento mais afastado possível do disco.

A partir do crescimento em ágar-sangue, semear 3 a 4 colônias em caldo Todd-Hewitt ou caldo tripticase-soja (TSB), incubando de um dia para outro. Após crescimento, transferir 0,5ml para dois tubos estéreis de 13 x 100mm, adicionando em seguida vermelho-fenol (0,02%) e ajustando o pH na faixa de 7,0 com solução de hidróxido de sódio. Adicionar em seguida 0,5ml da solução de desoxicolato de sódio a 2% em um dos tubos e 0,5ml  de salina a 0,85% no outro tubo. Incubar a 35ºC e examinar de meia em meia hora no período de 2 horas. O teste será considerado positivo quando houver lise ou solubilidade dos microrganismos no tubo contendo desoxicolato de sódio. O tubo-controle com salina permanecerá turvo. Algumas cepas de Streptococcus pneumoniae apresentam uma solubilidade parcial. Neste caso, serão classificados como tal, quando o teste da optoquina for positivo

Como foi dito, pode-se realizar o teste da bile-solubilidade diretamente na placa de Petri com o crescimento em ágar-sange, onde foi realizado teste de optoquina. Neste caso, pinga-se uma gota de desoxicolato de sódio a 2%, incubando-se em seguida a 35°C, durante 30 minutos, mantendo-se a placa de Petri voltada para cima. A lise do crescimento é característica de Streptococcus pneumoniae

 Tolerância ao Cloreto de Sódio A 6,5%,

Inocular duas a três colônias em caldo cloretado (8.5.22). O teste será positivo quando houver turvação do meio indicando crescimento.

 Prova do CAMP

Semear em ágar-sangue uma única estria da amostra-padrão de Staphylococcus aureus produtora de beta-hemolisina e, perpendicularmente a uma distância de 0,5 cm,  semear a amostra a ser testada, cuidando-se para que as estrias não se encontrem. Incubar entre 35 e 37ºC por l8 a 24 horas.

Em provas positivas, na região de confluência entre as linhas dos dois microrganismos, ocorre lise total das hemácias, com configuração de meia lua ou ponta de seta.

Interpretação:

• Coloração de Gram: Cocos Gram-positivos isolados e agrupados em cadeias
• Catalase: Negativa
• Reação hemolítica em ágar sangue: tipo beta, alfa e gama
• Sensibilidade à bacitracina: Sensível
• Sensibilidade à optoquina: Sensível
• Prova bile-esculina: positivo
• Tolerância ao cloreto de sódio a 6,%: (+) p/ Enterococos; (-) não enterococos
• Bile-solubilidade: (+) p/ S.pneumoniae; (-) S.viridans
• Prova do CAMP: positivo