Objetivos: Determinar a susceptibilidade de microrganismos a diferentes antibióticos por meio da técnica de difusão em ágar. Interpretar um antibiograma em função do diâmetro do halo de inibição de diferentes antibióticos.

Princípio: Os antibióticos impregnados nos discos, difundem no ágar e formam um halo de inibição ao seu redor quando encontram bactérias sensíveis. A bactérias resistentes crescem próximo ao disco, não ocorrendo a formação de halo

Material: Placas contendo ágar Mueller-Hinton, Microrganismo isolado em cultura pura (E.coli ou S.aureus) e suspenso em salina (inóculo)

Metodo:

Preparo do inóculo: Tomar 4 a 6 colônias do cultivo puro e inocular em um tubo com caldo BHI. Incubar o tubo por 2 a 5 horas até obter uma suspensão com turvação moderada. O inóculo deve ser adequadamente padronizado, pois caso contrário o resultado do antibiograma poderá ser alterado significativamente. Preparar as diluições de cada cultura em solução salina fisiológica até que a turbidez das suspensões ajustem-se a 10⁸ bactérias/ml. Comparar as suspensões contra um padrão de turvação (0,5ml de BaCl₂.2H₂O 0,048M em 99,5ml de H₂SO₄ 0,36N) preparado mensalmente.

Semeadura: Utilizar um “swab” estéril para cada cultura, imergindo-o no “inóculo” . Esgotar o excesso de líquido, apertando o “swab” contra a parede do tubo e semear cada microrganismo em ágar Mueller-Hinton em diferentes sentidos, assegurando uma semeadura uniforme.

Aplicação dos discos: Mantendo sempre a assepsia, depositar com uma pinça estéril  (imersa no álcool ou flambada na chama) os discos de antibióticos indicados sobre a superfície do inóculo em placa de ágar. Em seguida, com pinça estéril, exercer uma leve pressão sobre cada disco, para se obter uma boa aderência, a fim de permitir um contato do disco com a superfície do ágar. Caso contrário, poderá ocorrer erros na leitura dos resultados, devido a difusão não uniforme do antibiótico no ágar. Não se deve colocar mais de 9 discos por placas de 100mm, assim como, é muito importante levar em conta a distância entre eles.

Incubação: Depois de trinta minutos, as placas devem ser incubadas invertidas a 37ºC durante 16 a 18 horas.

Leitura: Observar e medir o halo de inibição, compararando com a tabela em anexo para determinar a susceptibilidade aos antibióticos: S (Sensível), R (Resistente) e I (Intermediário)

Interpretação:

A interpretação dos resultados do antibiograma pelo método dos discos de concentração única é baseada na correlação existente entre os parâmetros seguintes, verificados com relação a diferentes cepas bacterianas:

a) Concentração mínima inibitória (C.M.I.) - dose mínima de antibiótico que, adicionada ao meio de cultura (líquido ou sólido), é capaz de inibir totalmente o crescimento de um inoculum estândar.

b) Zona de inibição ( Z.I.) - diâmetro do halo estéril em torno do disco, em placas semeadas com as mesmas cepas bacterianas.

A observação clínica permitiu estabelecer, ademais, os valores de C.M.I. correspondentes ao sucesso terapêutico, de sorte que é possível inferir, pelo valor de Z.I., qual o antibiótico de escolha para a cepa bacteriana em questão.

Zonas de Inibição (em mm) correspondentes a diferentes graus de Suscetibilidade*

*R – Resistente;   S – Sensível;     I – Intermediária

Comentários

Discos utilizados no teste:

O método estândar recomendado pela “Food and Drug Administration” dos Estados Unidos utiliza discos de concentração única, que devem ser conservados ao abrigo da umidade (dessecadores) e em temperatura baixa (±3ºC ou - 14ºC, conforme o caso). Utilizam-se discos de concentração única e adequada, para cada antibiótico, à obtenção de halos de inibição indicadores do grau de sensibilidade de diferentes bactérias: penicilina (P), bacitracina (B) – 10UI.; ampicilina (A), colistina (C), estreptomicina (S), gentamicina (G), rifampicina (R), viomicina (VI) - 10 mcg; eritromicina (E), oleandomicina (OL) - 15 mcg; cefalotina (CE), cloranfenicol (CL), declomicina (D), gabromicina (GB), kanamicina (K), a. nalidíxico (NA), neomicina (N), novobiocina (NO), rovamicina (RO), tetraciclina (T), vancomicina (V) - 30 mcg; sulfas em geral, furadantina (F) - 300 mcg, etc.

Multidiscos são oferecidos em numerosas combinações, para atender a diferentes objetivos: infecções urinárias, feridas supuradas, etc.

Antibiograma- Métodos Convencionais e MIC

       Uma das tarefas mais importantes do laboratório de microbiologia clínica é avaliar a sensibilidade de microrganismos a antimicrobianos. O objetivo dos testes que fazem esta avaliação é prever, através da realização de provas “in vitro”, a probabilidade de sucesso terapêutico no uso das drogas avaliadas no tratamento de infecções causadas pelo microrganismo a ser testado.

O desenvolvimento de novos e variados mecanismos de resistência pelos microrganismos tem gerado o surgimento de um número cada vez maior de antimicrobianos. Esses dois fatores tem levados à necessidade de aprimoramento constante dos testes de sensibilidade a antimicrobianos. Existem varias opções para avaliação de sensibilidade a antimicrobianos, tais como disco-difusão, microdiluição em caldo, métodos rápidos automatizados e, mais recentemente, o E test, que é um teste comercial baseado no método de difusão em ágar.

       O método de disco-difusão é o mais utilizado no Brasil e na maioria dos países. Esse teste é realizado através da aplicação de um pequeno disco de papel de filtro impregnado com antimicrobiano a superfície do ágar onde o microrganismo foi inoculado. A difusão do antimicrobiano no ágar levará a formação de um halo de inibição de crescimento. Através da medida do diâmetro desse halo o microrganismo será classificado em resistente (R), intermediário (I) ou sensível (S). É um método bastante simples, fácil de ser realizado e que possui acuracia excelente quando realizado de maneira adequada. Uma desvantagem desse método é o fato dele fornecer apenas um resultado qualitativo (R, I ou S) ao contrário de outros testes que fornecem um resultado quantitativo expresso no valor da concentração inibitória mínima ou MIC. Porém, o conhecimento do MIC será importante para o clínico em algumas situações específicas.

A importância do MIC: O MIC expressa a concentração mínima do antimicrobiano que é necessária para inibir o crescimento do microrganismo que está sendo avaliado. Existem tabelas para a conversão desses valores em R, I ou S, sendo que no Brasil é normalmente utilizada a tabela preparada pelo National Committe for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), órgão americano responsável pela padronização de testes laboratoriais. A elaboracão dessas tabelas, levam em consideração não somente a potência “in vitro” do antimicrobiano mas também o nível sérico alcançado pela droga quando a dose preconizada é administrada. Dessa maneira, o conhecimento do MIC pode ser muito útil em algumas situações, como por exemplo infecções em sítios onde o antimicrobiano não apresenta boa penetração ou não se concentra muito bem, tais como meningites e endocardites. Nesses casos será necessário o uso de um antimicrobiano para o qual o microrganismo não só seja sensível mas possua um MIC bem mais baixo que o valor discriminante, isto é, de sensibilidade, ou do valor que separa as amostras sensíveis daquelas intermediárias. Outras situações nas quais o conhecimento do MIC pode ser útil são as infecções urinárias, principalmente aquelas causadas por microrganismos resistentes. Como a maioria dos antimicrobianosa é de excreção renal e alcança altas concentrações na saliva, infecções urinárias baixas podem ser, muitas vezes, tratadas com antimicrobiano para os quais o microrganismo apresente resistência intermediaria ou seja até mesmo resistente, mas apresente MIC próximo ao valor discriminante de resistência.

       O conhecimento do MIC pode ser útil também para o acompanhamento de infecções crônicas e/ou de difícil tratamento como osteomielites, por exemplo. Como o tratamento é muito prolongado, pode ocorrer desenvolvimento de resistência, que será detectado somente quando a infecção recidivar, exigindo reinício do tratamento. A detecção de aumento importante do MIC fará com que o clínico ajuste o esquema terapêutico antes que a amostra se torne resistente, não sendo necessário o reinicio do tratamento.

Nos últimos anos tem surgido uma série de aparelhos que realizam antibiograma de maneira automatizada. Esses aparelhos testam vários antimicrobianos simultaneamente e de maneira mais rápida que os métodos convencionais (4-6 horas ao invés de 18-24 horas). Esses métodos utilizam o princípio da microdiluição em caldo, porém poucas diluições de cada antimicrobiano são testadas, de maneira que é fornecido apenas o MIC aproximado. Sua maior vantagem é mesmo a rapidez, caso seja importante o conhecimento do MIC ou Concentração Inibitória Mínima especificando o antibiótico que necessita ser avaliado.

Antibiograma para fungos:

Os testes de sensibilidade a antimicrobianos também tem se tornado importantes para a avaliação de fungos, principalmente leveduras (Candida sp., Cryptococcus neoformans, etc.) Isso se deve tanto ao grande aumento nas opções terapêuticas para o tratamento de infecções fúngicas quanto ao aparecimento e aumento progressivo de cepas resistentes aos antifungicos diponíveis comercialmente. Os mesmos métodos utilizados para a avalização de bactérias têm sido aplicados para a avalição de fungos. Porém, a padronização desses métodos está sendo muito mais difícil devido a grande dificuldade encontrada na realização de estudos clínicos. A resposta clínica parece, em alguns casos, estar mais relacionada ao grau de imunidade do paciente do que a sensibilidade “in vitro”  do microrganismo. Isto dificulta muito a definição dos valores limites para classificação da amostra em sensível, intermediaria ou resistente. Na verdade, o NCCLS preconiza que seja liberado apenas o resultado do MIC, que devera ser avaliado e interpretado pelo medico assistente. Alguns métodos, tais como microdiluição em caldo e E test podem ser realizados em laboratórios clínicos e ajudar o clinico na escolha do antifungico mais adequado. Os casos onde a avaliação da sensibilidade parece ter maior utilidade seriam: a) tratamento de infecções sistêmicas por Candida sp.; b) em pacientes graves e/ou imunodeprimidos; c) tratamento de candidíase em pacientes HIV positivo.                                          

         Vários estudos têm demonstrado aumento progressivo do MIC ou superinfecção por espécies intrinsecamente mais resistentes nesses casos.

Antibiograma para Micobacterias: 

Devido principalmente à AIDS, houve um grande aumento na prevalência de infecções causadas por Micobacterias, principalmente M. tuberculosis e M. avium-intracellulare. Além disso, tem ocorrido grande aumento da prevalência de infecções causadas por cepas resistentes, tornando cada vez mais importante a avaliação da sensibilidade “in vitro” aos antimicrobianos normalmente utilizados no tratamento dessas infecções. Tal avaliação pode ser feita através do método das proporções (manual) ou através do aparelho Bactec 460 (mesmo aparelho utilizado para detecção de crescimento). Devido as dificuldades para a realização do método das proporções, muito trabalhoso, e ao custo dos testes realizados pelo Bactec, poucos laboratorios no Brasil oferecem esse serviço.

Em resumo, a terapêutica antimicrobiana de infecções causadas por algumas bactérias, fungos, vírus e parasitas continua a ser empírica porque ainda não foram detectados problemas de resistência, ou por falta de alternativas terapêuticas. O rápido aumento na prevalência de infecções causadas por microrganismos resistentes, porém, tem exigido não somente o aprimoramento das técnicas laboratoriais como também o maior conhecimento destas por parte do médico assistente. Este deve reconhecer as situações onde os diferentes testes estão indicados e saber interpretar os resultados fornecidos.