COLORAÇÃO DE GRAM

Objetivo: Observar formas, disposição e comportamento tintorial das bactérias. Distinguir bactérias Gram-positivas das Gram-negativas

Princípio: O método de Gram permite classificar  as bactérias em dois grandes grupos: as que retêm Violeta de genciana ( Gram-positiva ) e as que não retém o violeta genciana (Gram-negativa). Além do mais, é útil para determinar a forma ( cocos e bacilos ), e o arranjo das células após a divisão celular ( em forma de cacho, cadeias, sarcina  etc., ). As células bacterianas são caracterizadas morfologicamente:

• Comportamento tintorial: Gram-positiva ou Gram-negativa
• Forma: cocos (esféricos), bacilos (cilindricos) e espirilos (espiralados)
• Arranjo: Disposição das células entre si. Os cocos podem estar isolados, aos pares(diplococos), agrupados em cachos (estafilococos), em cadeia (estreptococos). Os bacilos e espirilos se apresentam em geral como células isoladas porém,  ocasionalmente,   pode-se   observar   bacilos  aos  pares (diplobacilos)  ou  em cadeia ( estreptobacilos ).

             Quanto ao tamanho, as células bacterianas são sempre de dimensões microscópicas, o diâmetro da maioria delas varia de 0,2 a 1,5 mm e comprimento de 1 a 6 mm.

 Material: Reagentes de Gram: sol. cristal-violeta 2%; sol. aquosa de iodo (Lugol); mistura álcool-acetona; sol. alcoólica de safranina[1], Lâminas: Suporte para lâminas; alça de platina; Bico de Bunsen;  Microscópio; Óleo de Imersão

 Método:

• Preparar o esfregaço e fixar ao calor
• Cobrir a área do esfregaço com a solução  de cristal-violeta  por cerca de 1min.;
• Lavar com água corrente e escorrer o excesso de água;
• Cobrir a área do esfregaço com a solução de iodo durante cerca de 1 minuto;
• Descorar a lâmina com a mistura álcool-acetona, até que o solvente escorra incolor;
• Cobrir o esfregaço com a solução de safranina¹ por cerca de 30 segundos;
• Lavar com água corrente;
• Deixar secar ao ar
• Observar ao microscópio em lente de 100X, com óleo de imersão

REAGENTES PARA COLORAÇÃO DE GRAM

Interpretação: As bactérias Gram-positivas retém o cristal-violeta e se apresentam com coloração violeta, enquanto as Gram-negativas são descoradas pelo álcool-acetona, sendo, portanto, coradas pela safranina e se apresentam róseas.

Comentários:

Em 1884, o médico Dinamarquês Cristian Gram descobriu, empiricamente, ao corar cortes histológicos com violeta genciana, através do método de Ehrlich (1882), que as bactérias que eles continham não eram descoradas pelo álcool, se previamente tratadas com solução de iodo. Ele adicionou a este procedimento um contra-corante (safranina, fucsina básica, etc.,) e estabeleceu, a partir dai, uma metodologia de coloração diferencial.

            Ao longo destes anos, o mecanismo de coloração de Gram foi sobejamente estudado. E nesta medida, muitas modificações foram propostas, sem contudo afetar substancialmente a idéia original.

Os microrganismos respondem diferentemente ao método. Há os que retém o pigmento característico do corante (cristal violeta) em vista da formação de um complexo com a solução iodo-iodeto (lugol), apesar da lavagem com álcool ou acetona, motivando uma desidratação da parede celular, diminuição da porosidade e da permeabilidade. São os Gram-positivos. E há os que permitem a remoção do pigmento do corante pela lavagem com álcool ou acetona, em decorrência da extração de lipídios da parede, o que leva a um aumento da porosidade celular. São os Gram-negativos. Tratando, os dois grupos, com contra-corante (safranina ou fucsina básica) observa-se que as células do primeiro (Gram-positivos) não são afetadas e permanecem azuis ou violeta; enquanto que para o outro (Gram-negativos) as células absorvem o contra-corante, tornando-as vermelhas.

A parede celular bacteriana apresenta particularidades na sua composição química. Este dado é absolutamente coincidente com a resposta à reação de Gram. A presença de maior teor de peptideoglicano nos Gram-positivos, tem sido apontado como fator determinante da retenção do complexo ao nível de parede. Tanto assim que os protoplastos, produzidos por ação de lisozima ou por efeito de penicilina sobre os Gram-positivos, não são capazes de reter o pigmento, após lavagem com álcool ou acetona. Portanto, a reação de Gram resulta essencialmente das interações do complexo, cristal violeta ou violeta de genciana e iodo, com o peptídeoglicano da parede celular, numa combinação ainda não de todo esclarecida, na qual a presença de ribonucleato de magnésio é mediadora da fixação do corante.

A reação de Gram tem largo relacionamento com o estado fisiológico da célula. As culturas jovens respondem melhor à diferenciação tintorial. As culturas velhas de Gram-positivas podem se apresentar como Gram-variaável, pela perda da capacidade de retenção do corante.

A coloração é hoje empregada com elevado significação taxonômica. Assim, são Gram-positivos quase todos os bacilos esporulados, móveis por flagelos peritríquios e a quase totalidade dos cocos. São Gram-negativos a quase totalidade dos bacilos não esporulados, móveis por flagelos peritríquios  ou polares, e todas as espiroquetas, apenas para citar alguns exemplos.

Questões

1. A coloração de Gram possibilita caracterizar as bactérias quanto ao comportamento tintorial (Gram-positiva e Gram-negativa), morfologia (cocos, bacilos, espirilos) e arranjo (em cacho, em cadeias, aos pares). Qual o significado destas informações para a medicina?
2. A coloração de Gram exerce alguma importância em diagnósticos clínicos de bactérias isoladas de infecções humanas e animais? Citar pelo menos um exemplo.
3. Empiricamente, Gram estabeleceu uma sequência para a aplicação dos corantes que integram a metodologia. Comentar os resultados possíveis de serem obtidos com as inversões da sequência referida no método.
4. Sabe-se que se a parede celular é o sítio preferido pela fixação da reação de Gram. Fazer um esquema mostrando esta associação, para o caso típico de uma bactéria Gram-positiva.
5. Sendo o Gram um método de coloração diferencial, como esta reação pode ser empregada para a verificação do estado de pureza de uma determinada cultura?
6. Comente o efeito da penicilina sobre a parede celular bacteriana, correlacionando-o com a reação tintorial de Gram.
7. Comente a frase: “Uma bactéria Gram-negativa pode tornar-se Gram-positiva, dependendo do tempo de incubação da cultura, mas o inverso não é verdadeiro”.
8. Os procedimentos realizados estão de acordo com o protocolo. Comente as alterações ou adaptações realizadas
9. Relacione os matérias listados neste protocolo que não foram utilizados e quais outros materiais utilizados. Será que houve alguma falha no procedimento pela falta ou substituição do material?
10. Quais as dificuldades encontradas na realização dessa prática?
11. Os procedimentos de biossegurança foram seguidos com rigor? Quais os possíveis riscos de acidente de trabalho que os alunos e o professor sofreram? Comente sobre as normas de biossegurança.
12. Elabore 10 questões a respeito da prática ao seu professor, para melhor esclarecimento das suas dúvidas