Objetivo: Observar microrganismos vivos em material biológico
Princípio: O exame a fresco fundamenta-se na observação de microrganismos vivos (bactérias, protozoários, fungos e leveduras) em suspensão do material biológico entre lâminas e lamínulas, onde se pode observar as formas e os movimentos dos mesmos.
As bactérias se observa em formas de bacilos, cocos ou espirilos, com ou sem movimento[1]. Os fungos se observa as hifas filamentosas com ou sem septos. As leveduras são esferas maiores com ou sem brotamento. Os protozoários se observa em forma de cistos ou trofozoítos, com ou sem movimento. Dependendo do material, pode-se observar algumas células (células epiteliais, leucócitos, hemácias, etc., ), fibras, cristais, ovos de helmintos, etc.,
Material: Material biológico em suspensão, lâminas, lamínulas, microscópio, pipeta Pasteur (ou conta-gotas)
Método: Coletar uma gota do material biológico, colocar no centro da lâmina e sobrepor cuidadosamente (sem formar bolhas) uma lamínula. Levar ao microscópio e observar em objetiva de 40 vezes[2]. Após a observação, desprezar a lâmina e lamínula em um frasco contendo detergente.
Interpretação: Anotar o tipo de microrganismo (bactérias, protozoários, fungos ou leveduras), as formas e a motilidade.
Comentários: O Exame a fresco é um método de observação que preserva a forma natural dos microrganismos e reduzem as distorções que somente ocorrem quando as preparações são secas e fixadas. Em vista da semi-transparência das células, estas preparações não são satisfatoriamente visualizadas a microscópio ótico de campo luminoso. Assim, se examinados pequenos organismos, como bactérias, vivas e suspensas em fluidos, veremos que a observação é precária, e quase impossível discernir claramente sobre qualquer de suas estruturas internas. É como se estivéssemos vendo um fragmento de vidro claro imerso em água cristalina.
As preparações a fresco exigem um manuseio completo do microscópio de campo luminoso. Assim é necessário que se façam ajustes na intensidade da luz que ilumina os objetos a serem observados, bem como uma regulagem adequada do condensador. Se possível, é conveniente o emprego de filtros, de modo a melhorar a qualidade da imagem, em fase da iluminação deste sistema ótico. Pode-se lançar mão de outros instrumentos. Uma das alternativas é a microscopia de contraste de fase. A outra forma é o emprego da microscopia de campo escuro.
Uma preparação a fresco de uma dada espécie bacteriana mostrará, por certo, que ela é incolor, mesmo a despeito de vir produzir um pigmento quando cultivada em caldo ou ágar. Esta circunstância levou a utilização, em microbiologia, de vários corantes que, ao tingir a célula com uma certa coloração, permitiu a visualização de detalhes quanto a arranjo, forma, estruturas, etc.,
Questões:
- Porque as dimensões dos vários tipos morfológicos de microrganismos podem ser melhor aferidas através de preparações a fresco?
- Para que serve uma preparação em gota pendente? Ela oferece alguma indicação sobre a viabilidade de uma cultura
- Citar alguns cuidados, a serem tomados para execução satisfatória do exame a fresco?
- Quais as limitações do exame a fresco?
- Em que circunstâncias, no diagnóstico laboratorial de doenças infecciosas, o exame a fresco deve ser aplicado?
- Qual a principal informação sobre o microrganismo que o exame a fresco pode fornecer?
- Os procedimentos realizados estão de acordo com o protocolo. Comente as alterações ou adaptações realizadas
- Relacione os matérias listados neste protocolo que não foram utilizados e quais outros materiais utilizados. Será que houve alguma falha no procedimento pela falta ou substituição do material?
- Quais as dificuldades encontradas na realização dessa prática?
- Os procedimentos de biossegurança foram seguidos com rigor? Quais os possíveis riscos de acidente de trabalho que os alunos e o professor sofreram? Comente sobre as normas de biossegurança.
- Elabore 10 questões a respeito da prática ao seu professor, para melhor esclarecimento das suas dúvidas