ENTEROBACTERIAS

COPROCULTURA

Objetivos: Isolar germes enteropatogênicos de fezes e observar as características morfológicas das colônias dos princiapais germes.

Princípio: A coprocultura fundamenta-se na pesquisa dos enteropatógenos nas fezes, tais como Escherichia coli, Salmonella, Shigella, outras Enterobacterias e Enterococos.

                A pesquisa de outros enteropatógenos tais como Campylobacter, Vibrio cholerae, são realizados em meios de cultura especiais, devendo ser solicitada pelo médico

Material:  Amostra de fezes[1], ágar verde-brilhante ( Kristensen), ágar EMB, ágar SS e caldo selenito ou tetrationato, alça de platina, bico de Bunsen, estufa a 37ºC.

Metodologia:

• Semear as fezes pelo método de esgotamento, nos seguintes meios de cultura: ágar verde-brilhante (Kristensen) , ágar EMB, ágar SS e ágar-sangue.
• Incubar os meios a 37ºC por 24 a 48 horas.
• Observar as características da colônias e proceder a identificação (provas bioquímicas)
• A semeadura deve ser feita com alça de platina ou bastão em L (espátula de Drigalsk), em três setores de cada placa, de maneira a esgotar progressivamente o inóculo, com vistas à obtenção de colônias isoladas.
• Semear primeiro os meios de ágar verde-brilhante (Kristensen) e ágar SS e, sem recarregar a alça,  passar para o meio EMB ou Mac Conkey.
• Para o enriquecimento, semear um fragmento de fezes mais ou menos do tamanho de uma ervilha (ou, em se tratando de fezes líquidas ou de suspensão em meio de transporte, cerca de 1 a 2 ml) em tubos de caldo selenito.
• Incubar a 37ºC e após 18-24 horas, transportar para os meios de isolamento (Kristensen, SS e EMB).

 Resultados:

                No meio de Kristensen (ágar verde brilhante), as colônias de salmonella são róseas, transparentes e circulares; os Proteus são inibidos e crescem apenas na variante “O”, formando colônias róseas circunscritas; os coliformes são inibidos substancialmente, porém os que se desenvolvem produzem colônias opacas e amarelas. Quanto às Shigellas, não se desenvolvem no meio de Kristensen.

                Em ágar SS, crescem bem tanto as Salmonellas quanto as Shigellas, sob a forma de colônias circulares, incolores e transparentes; os Proteus dão colônias “O” que só se distinguem das colônias de Salmonella por serem um pouco maiores e menos transparentes e os coliformes são inibidos ou formam colônias vermelhas.

                Em ágar EMB, as Salmonellas e Shigellas crescem sob a forma de colônias róseas, transparentes, ao passo que os coliformes produzem colônias negras (Escherichia coli) ou colônias mucóides róseas, com centro negro (Enterobacter); os Proteus são inibidos e tendem a formar um véu invasor.

2. IDENTIFICAÇÃO BIOQUÍMICA -  ENTEROBACTERIACEAE

Objetivos: Realizar provas bioquímicas para identificar as bactérias da familia Enterobacteriaceae

Princípio: As bactéria são identificadas por características morfológicas, fisiológicas, bioquímicas e sorológicas.  As provas bioquímicas se baseiam no metabolismo bacteriano, onde se observa a produção ou degradação de metabólitos, que reagem no meio de identificação produzindo cores características para cada prova.

Material: Placas com colônias isoladas de bactérias Gram-negativas, meios de identificação (EPM, MILI e CIT), alça de platina.

Método: Com as placas contendo colônias isoladas de bactérias Gram-negativas, observar as características das colônias, “pescar” a colônia suspeita,  e semear nos seguintes meios de identificação presuntória: EPM[2], MILI e CIT. Para inocular o meio EPM, introduzir a agulha até o fundo do tubo e ao retirá-la semear a superfície do meio. A inoculação do MILI deve ser feita por picada central, introduzindo a agulha até o fundo do tubo. Incubar a 37ºC por 18-24horas. Fazer a leitura das seguintes provas bioquímicas:

(*)  Adicionar uma gota do reativo de Kovacs e verificar o aparecimento da cor velmelha em forma de anel na superfície do meio

Interpretação:  Averiguar as características bioquímicas e procurar na tabela em anexo o germe que mais se assemelha às características

MEIO EPM

• Fermentação da glicose: cor amarela
• Produção de gás: formação de bolhas ou deslocamento do meio do fundo do tubo
• Produção de H₂S: Enegrecimento do meio em qualquer intensidade
• Hidrólise da uréia: Aparecimento da cor azul ou verde-azulada (reação fraca) que se estende para a base do meio, envolvendo-a totalmente ou não
• Desaminação do Triptofano: aparecimento de cor verde-garrafa no superfície do meio. Quando a reação é negativa, a superfície do meio adquire cor azul ou, raramente, amarela

MEIO MILI

• Motilidade: a bactéria móvel cresce além da picada turvando parcial ou totalmente o meio. A bactéria imóvel cresce somente na picada.
• Descarboxilação da Lisina: quando a lisina é descarboxilada, o meio adquire cor púrpura acentuada ou discreta. Quando o aminoácido não é utilizado, o meio adquire cor amarela nítida nos seus 2/3 inferiores. Considerar o teste positivo sempre que o meio não estiver amarelo
• Produção de indol:  após a leitura dos testes de motilidade e lisina, adicionar 3 a 4 gotas de reativo de Kovacs a superfície do meio e agitar levemente. Quando a bactéria produz indol, o reativo adquire cor rosa ou vermelha. Quando não o produz, o reativo mantém a sua cor inalterada

CITRATO: a utilização do citrato revela-se pelo aparecimento de cor azul na superfície do meio. O teste deve ser considerado negativo quando a cor do  meio não sofrer alteração

Características dos germes da familia Enterobacteriaceae nos meio EPM-MILI-CIT.